此種染色法由丹麥微生物學家Hans Christian Gram 於西元1884 年所創, 是最常用的細菌鑑別染色法。步驟如下:

1.初染劑(Primary Stain):初染劑乃結晶紫(crystal violet),使細菌染成紫藍色。

2.媒染劑(Mordant):乃革蘭氏碘液(Gram's Iodine),可與初染劑結合而形成不溶性複合物。所形成之結晶 紫-碘(CV-I)複合體藉以加強染料顏色,此時所有細菌均成紫黑色。

3.脫色劑(Decoloring agent):乃95%乙醇,此試劑具有脂溶性(lipid solvent) 與蛋白質脫水劑之雙重功能。其作用依微生物細胞壁所含脂肪濃度而定。[[格蘭氏 陽性菌]]之脂質含量低且細胞壁具有厚層之肽聚醣,乃保留CV-I 複合體之主要因素,因少量之脂質經乙醇作用,立刻溶解,形成細胞壁之細孔,但此細孔隨即因乙醇之脫水作用而封閉,以致緊密結合之初染劑不易移去,終於保留紫色。[[革蘭氏陰性菌]]細胞壁中之外層含高量之脂質,易為乙醇溶解,形成大孔。即使引起細胞壁蛋白之脫水也不易封閉該孔,因此有利於未結合CV-I 複合體之釋出,致使菌體成無色。

4.複染劑(Counterstain):最後試劑為番紅(Safranin),凡經上述脫色之細菌,被此染料染成紅色。因僅革蘭氏陰性菌發生脫色,故於此步驟能吸收複染劑。革蘭氏陽性菌則保留初染時之紫色。

革蘭氏碘液就是2% iodine + 3% potassium iodide 溶於 70% ethanol。



革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的比較

性 質
革蘭氏陽性菌
革蘭氏陰性菌
染色結果
仍維持紫色
由紫色變為紅色
細胞壁組成
脂質含量較少(1-4%) 脂質含量較多(11-22%)
細胞壁結構 單層,且較厚(15-80 nm) 三層,且較薄(10-15 nm)
對鹼液的抵抗力 不溶於 10% KOH 中 可溶於 10% KOH 中
孢子之產生 常見 少見
對物理狀況之抵抗力

營養需求 多數都較複雜 需求簡單
常見的菌種 大多數的球菌和產孢桿菌 非產孢桿菌


額外補充一個資訊給各位:人體重要致病菌

染出來的Staphylococcus aureus


步驟

(一)抹片製備

1. 載玻片先用清潔劑洗淨浸泡於95%酒精中

2. 取純系化的單離細菌接種(E .coli)至LB 培養液中,經18 小時增殖後。

3. 取菌液均勻分散於載玻片上,可快速在酒精燈上加熱一下。

(二)染色

1.將塗抹覆以結晶紫,靜置一分鐘。

2.以蒸餾水輕洗。

3.覆以革蘭氏碘液媒染劑,靜置一分鐘。

4.以蒸餾水清洗。

5.以95%乙醇脫色,勿脫色過度,逐滴滴下,至發現結晶紫未自塗抹中釋出為度。

6.以蒸餾水輕洗。

7.以番紅或沙黃複染45 秒。

8. 以蒸餾水輕洗。

9.以吸水紙吸乾,並用油鏡觀察

注意事項

1.染色時,脫色步驟可影響抹片之製備成敗與否。切記脫色過渡時可使初染流失,使革蘭氏陽性菌成革蘭氏陰性菌。但脫色不足,則不能完全除去CV-I 複合 物,結果是革蘭氏陰性菌成革蘭氏陽性菌。

2.將玻片以蒸餾水充分輕洗,以除去剩餘之染液。

3.宜使用未超過24 小時之新鮮培養,置備抹片。因菌齡老化,尤以革蘭氏陽性 菌易失去保留初染之能力,而顯示革蘭氏易變性。此時,部份菌體染呈紫色。

 

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