快樂小藥師 Im pharmacist nichts glücklich

此種染色法由丹麥微生物學家Hans Christian Gram 於西元1884 年所創， 是最常用的細菌鑑別染色法。步驟如下：

1.初染劑（Primary Stain）：初染劑乃結晶紫（crystal violet），使細菌染成紫藍色。

2.媒染劑（Mordant）：乃革蘭氏碘液（Gram's Iodine），可與初染劑結合而形成不溶性複合物。所形成之結晶 紫-碘（CV-I）複合體藉以加強染料顏色，此時所有細菌均成紫黑色。

3.脫色劑（Decoloring agent）：乃95%乙醇，此試劑具有脂溶性（lipid solvent） 與蛋白質脫水劑之雙重功能。其作用依微生物細胞壁所含脂肪濃度而定。[[格蘭氏 陽性菌]]之脂質含量低且細胞壁具有厚層之肽聚醣，乃保留CV-I 複合體之主要因素，因少量之脂質經乙醇作用，立刻溶解，形成細胞壁之細孔，但此細孔隨即因乙醇之脫水作用而封閉，以致緊密結合之初染劑不易移去，終於保留紫色。[[革蘭氏陰性菌]]細胞壁中之外層含高量之脂質，易為乙醇溶解，形成大孔。即使引起細胞壁蛋白之脫水也不易封閉該孔，因此有利於未結合CV-I 複合體之釋出，致使菌體成無色。

4.複染劑（Counterstain）：最後試劑為番紅（Safranin），凡經上述脫色之細菌，被此染料染成紅色。因僅革蘭氏陰性菌發生脫色，故於此步驟能吸收複染劑。革蘭氏陽性菌則保留初染時之紫色。

革蘭氏碘液就是2% iodine ＋ 3% potassium iodide 溶於 70% ethanol。

革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的比較

額外補充一個資訊給各位：人體重要致病菌

染出來的Staphylococcus aureus

步驟

(一)抹片製備

1. 載玻片先用清潔劑洗淨浸泡於95%酒精中

2. 取純系化的單離細菌接種(E .coli)至LB 培養液中，經18 小時增殖後。

3. 取菌液均勻分散於載玻片上，可快速在酒精燈上加熱一下。

(二)染色

1.將塗抹覆以結晶紫，靜置一分鐘。

2.以蒸餾水輕洗。

3.覆以革蘭氏碘液媒染劑，靜置一分鐘。

4.以蒸餾水清洗。

5.以95%乙醇脫色，勿脫色過度，逐滴滴下，至發現結晶紫未自塗抹中釋出為度。

6.以蒸餾水輕洗。

7.以番紅或沙黃複染45 秒。

8. 以蒸餾水輕洗。

9.以吸水紙吸乾，並用油鏡觀察

注意事項

1.染色時，脫色步驟可影響抹片之製備成敗與否。切記脫色過渡時可使初染流失，使革蘭氏陽性菌成革蘭氏陰性菌。但脫色不足，則不能完全除去CV-I 複合 物，結果是革蘭氏陰性菌成革蘭氏陽性菌。

2.將玻片以蒸餾水充分輕洗，以除去剩餘之染液。

3.宜使用未超過24 小時之新鮮培養，置備抹片。因菌齡老化，尤以革蘭氏陽性 菌易失去保留初染之能力，而顯示革蘭氏易變性。此時，部份菌體染呈紫色。